Real Time PCR 의 원리와 Amplication, Melting curve 차이점 확인하기
■ 기본 PCR (Polymerase Chain Reaction) 진행과정
Step 1 : Denaturation (변성)
- 온도 : 약 94 ~ 98℃
- DNA 이중가닥이 열려서 두개의 단일 가닥 (single stranded DNA)으로 분리됩니다.
Step2 : Annealing (접합)
- 온도 : 약 50 ~ 65℃
- 설계한 프라이머 (Primer)가 각각의 단일 가닥 DNA에 결합합니다.
Step3 : Extension (연장)
- 온도 : 약 68 ~75℃
- DNA polymerase 효소가 프라이머에 결합된 자리부터 새로운 DNA 가닥을 복제해 나갑니다.
이 3던계를 한번의 cycle 이라고 하고, 보통 30 ~40 cycle을 반복하여 수백만 배로 DNA 증폭을 진행합니다.
PCR (Polymerase Chain Reaction)은 원하는 DNA 서열에 특이적으로 결합 할 수 있는 Primer (프라이머)를 설계하여, 특정 DNA만을 선택적으로 증폭하는 기술 입니다. 초기에는 아주 소량의 DNA만 있어도, cycle 수를 늘림으로써 수백만 배 이상으로 증폭할 수 있습니다. 이 과정을 통해 실험에 필요한 DNA의 양을 빠르게 확보 할 수 있습니다.
■ Real Time PCR 이란 ?
Real Time PCR 은 일반 PCR 과 기본 원리는 같지만, 추가로 " DNA가 증폭되는 양을 실시간으로 모니터링 " 할 수 있는 기술을 의미 합니다.
Real Time PCR 의 주요 특징
1. 형광 물질 ( Fluorescent dye 또는 probe) 사용
- 증폭되는 DNA 양에 비례하여 형광 신호가 강해집니다.
- 대표적인 방법 : SYBR Green (이중가닥 DNA가 결합하는 형광 증가)
- TaqMan Probe (특정 서열이 결합하는 형광 프로브 사용)
2. 증폭 곡선 (Amplication Curve) 분석
- 사이클 수 (cycle number)에 따라 형광이 증가하는 모습을 그래프로 확인 할 수 있습니다.
- Ct값 (cycle threshold) : 형광 신호가 특정 기준치를 넘는 사이클 수 ---> DNA 양을 정량할 때 사용
3. 멜팅 커브 (Melting Curve) 분석
- 증폭이 끝난 뒤, DNA 의 순도와 비특이적 증폭 여부를 확인하기 위해 온도를 서서히 올려가며 이중가닥 DNA 가
풀리는 특성을 분석
- 추가 검증을 통해 PCR 산물의 정확성을 확인 할 수 있습니다.
■ Melting Curve 와 Derivative Curve의 차이
- Melting Curve (Raw) : 온도에 따라 형광 감소를 직접 그린 곡선
- Derivative Curve (-dF/dT) : 형광 감소 속도 (=변화율)을 계산해 피크 형태로 나타냄
★ Amplication Curve 를 보는 이유
1. DNA 증폭이 정상적으로 일어 났는지 확인
- 초기에는 fluorescence (형광)이 거의 없다가, 증폭이 진행되면서 형광 신호가 급격히 증가합니다.
- S자형 (Sigmodial) 곡선이 나타나야 정상적인 증폭이 이루어 졌다고 볼 수 있습니다.
- 만약 신호가 거의 오르지 않거나 이상한 형태라면, PCR 반응에 문제가 있을 가능성이 있습니다.
문제 발생의 대표적 이유 : 프라이머 (primer) 문제, 시약 문제
2. Ct값 (cycle threshold) 확인
- 증폭 곡선이 상승하는 지점을 기준으로 Ct(Cg)값을 얻습니다.
- Ct값은 " DNA가 얼마나 빨리 검출 되었는가 " 를 나타내는데, 이는 초기 DNA 양을 반영합니다
ex) Ct값이 낮다 → 시작할 때 DNA가 많았다
Ct 값이 높다 → 시작할 때 DNA 가 적었다
3. 샘플 간 비교 및 정량 분석
- 여러 샘플의 Ct 값을 비교해서
(1) 유전자 발현양 비교
(2) 감염여부 확인
(3) 돌연변이 검출 등을 할 수 있습니다.
- 표준 곡선 (standard curve)을 이용하면 절대 정량 (Absolute quantification)도 가능합니다.
4. 실험 오류 및 오염 여부 판별
- 비정상적인 Amplication curve (예, 비정상적으로 늦은 신호 상승, flat한 선 등)은 오염, 시약 문제, 세팅 오류를
의미 할 수 있습니다.
- No Template Control (NTC) 에서도 amplication 이 뜨면, 오염을 의심해야 합니다.
★ Melting Curve 분석
1. 비특이적 증폭 여부 확인
- PCR 은 종종 원치 않는 비특이적 산물 (non-specific product) 이나 primer-drimer 를 생성할 수 있습니다.
- Melting curve 는 증폭 산물을 점진적으로 가열하면서 DNA 이중가닥이 풀리는 (=Denaturation) 온도를
측정합니다.
- 비특이적 산물은 주로 본래 목표한 DNA 보다 녹는 온도 (Tm, Melting temperature)가 다르기 때문에
원하는 산물은 특정 Tm에서 sharp 한 peak 를 형성하지만, 비특이적 산물이나 Primer-Dimer 는 다른
Tm에서 별도의 peak를 보이거나 board (흐릿한) 형태로 나타납니다.
2. 목표 산물의 순도 확인
- Single sharp peak 가 보이면, 하나의 특정한 PCR 산물만 증폭이 된 것이라고 볼 수 있습니다.
- 여러개의 peak 가 보이며, 여러 가지 다른 DNA 조각들도 같이 증폭 되었을 가능성을 시사합니다.
3. Primer - Dimer 검출
- Primer-Dimer 는 매우 짧은 DNA 조각이기 때문에 일반적으로 Tm이 낮은 곳에 별도 peak 를 나타납니다.
- 이를 통해 실험 오류나 최적화가 필요한지 판단 할 수 있습니다.
4. qPCR 결과의 신뢰성 검증
- Real-Time PCR 결과 (증폭곡선)만으로는 특정성 (Specificity) 을 알 수 없습니다.
- Melting curve 분석을 통해 정확한 증폭이 이루어 졌는지 확인함으로써, 결과의 신뢰성을 높일 수 있습니다.
즉, Melting Curve 를 보는 것은 " qPCR 결과가 정확한지 검증하기 위해서 " 라는 필수 과정입니다.
★ Real Time PCR 에서 형광을 감지하는 지점 요약
■ Amplication Curve
1. 증폭되는 이중가닥 DNA의 양에 비례해 형광이 증가합니다.
2. 이는 대부분 extention 온도 (72℃) 혹은 그 직후의 short hold 구간에서 측정됩니다
3. 형광은 각 cycle 마다 1번씩 측정되며, 이를 쌓아서 증폭곡선 (amplication curve)를 만듭니다.
■ Melting Cuve
1. PCR 종류 후, 별도 과정에서 진행됩니다.
2. 온도를 60℃ 에서 90℃로 천천히 상승 시키면 이중 가닥 DNA가 열에 의해서 풀리면 SYBR Green 같은
형광염료가 떨어져 나가며 형광이 급감합니다
3. 형광의 급격한 감소가 발생하는 온도를 기준으로 Melting Temperature (Tm) 값을 구합니다.
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